質粒提取原理及流程
 質粒提取試劑盒簡介：
     質粒(Plasmid)是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小從1-200kb不等，為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細胞中。質粒主要存在于細菌、放線菌和真菌細胞中，它具有自主復制和轉錄能力，能在子代細胞中保持恒定的拷貝數(shù)，并表達所攜帶的遺傳信息。
 
質粒提取原理及流程：
     較常用的質粒DNA提取方法有3種：堿裂解法、煮沸法和去污劑(如Triton和SDS)裂解法。前兩種方法比較劇烈，適用于較小的質粒(<15kb)。去污劑裂解法則比較溫和，一般用于分離大質粒(>15kb)。堿裂解法是一種應用為廣泛的制備質粒DNA的方法，其原理為：染色體DNA比質粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質粒DNA為共價閉合環(huán)狀分子；當用堿處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的質粒DNA在回到中性時即恢復其天然構象；變性染色體DNA的片段與變性蛋白質和細胞碎片結合形成沉淀，而復性的超螺旋質粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，離心去除沉淀后，就可從上清中回收質粒DNA。目前，市面上質粒提取試劑盒大多數(shù)都是采取上述的堿裂解方法，不同之處在于純化方式。目前比較常用的純化系統(tǒng)是硅基質吸附材料，其原理為在高鹽環(huán)境下質粒DNA能夠結合到硅基質上，然后用低鹽緩沖液或水將質粒DNA從硅基質上洗脫下來。得到的質粒可以用于酶切、PCR、測序、細菌轉化、轉染等分子生物學實驗。
 
影響質粒提取的因素：
     質粒提取的得率和質量與很多因素有關，如宿主菌的種類和培養(yǎng)條件、細胞的裂解、質粒拷貝數(shù)、質粒的穩(wěn)定性、抗生素、吸附柱的吸附量等。

宿主菌種類
     質粒主要存在于細菌、放線菌和真菌細胞中，多數(shù)情況下我們是從大腸桿菌中提取質粒。大腸桿菌的菌株不同會影響質粒提取的質量。從宿主菌如DH5α和*0中可以得到高質量的質粒DNA。HBl01和它的衍生菌株，如TG1和JM系列會在裂解時產(chǎn)生大量的糖類，如果沒有*去除，將抑制后續(xù)實驗中的酶活性，影響質粒DNA提取的質量。另外，有些菌株有非常高的內(nèi)切酶活性，會降低DNA的得率。因此推薦使用DH5α和*0來提取質粒DNA。
 
培養(yǎng)時間
    從固體培養(yǎng)基平板上挑取一個單菌落，接種到培養(yǎng)物中(含有相關抗生素的液體培養(yǎng)基中)，振蕩培養(yǎng)12-16小時。不應超過16小時，因為這時細胞開始裂解，使得質粒的得率降低，也會導致質粒丟失或質粒變異。
 
質粒擴增
    氯霉素能抑制宿主細胞蛋白質和DNA的合成，但對松弛型質粒的復制沒有影響。因此，在細菌培養(yǎng)液中加入氯霉素可提高松弛型質粒的拷貝數(shù)。由于氯霉素抑制了宿主細胞蛋白質和DNA的合成，從而抑制了染色體的復制，但質粒復制所用的酶半衰期較長，故質粒仍可繼續(xù)復制，這樣既可增加質粒產(chǎn)量，又可降低細胞的數(shù)量，使細菌裂解液的粘度降低而便于操作。常用于擴增的氯霉素濃度為170ug/ml 。
 
抗生素
    在菌株的各生長階段都應加入抗生素篩選。現(xiàn)在用的許多質粒都不含有在細胞分裂時確保平均分配的par位點，無質粒的子細胞在無抗生素時復制速度遠大于含質粒的細胞。

幾種常用抗生素的濃度

質?？截悢?shù): 
      質粒拷貝數(shù)常用的定義是指生長在標準的培養(yǎng)基下每個細菌細胞中所含有的質粒DNA分子的數(shù)目。每個細胞中的質粒數(shù)主要決定于質粒本身的起始復制機制。按照復制性質，可以把質粒分為兩類：一類是嚴緊型質粒，當細胞染色體復制一次時，質粒也復制一次，每個細胞內(nèi)只有1-2個質粒，如F因子；另一類是松弛型質粒，當染色體復制停止后仍然能繼續(xù)復制，每一個細胞內(nèi)一般有20個左右質粒，如ColEl質粒。一般分子量較大的質粒屬嚴緊型，分子量較小的質粒屬松弛型。質粒的復制有時和它們的宿主細胞有關，某些質粒在大腸桿菌內(nèi)的復制屬嚴緊型，而在變形桿菌內(nèi)則屬松弛型。

部分質粒的拷貝數(shù)

菌液收集及裂解
     細菌收集可以通過離心來進行，不同的質?？截悢?shù)，菌液量的需求不同，對于低拷貝的質粒，要相應增加菌液的量。菌液是在堿性環(huán)境下裂解的，由于不同的宿主菌細胞壁厚薄的差異，細胞的破壁程度不同， 對于細胞壁較厚的宿主菌， 先要進行破壁處理：
革蘭氏陰性菌——不用特殊處理，堿裂解時就能有效破壁
革蘭氏陽性菌——溶菌酶處理
酵母和絲狀真菌——酵母破壁酶或玻璃珠
 
      菌液收集、重懸以及宿主菌細胞破壁后，細胞在含有RNase A的NaOH/SDS(溶液Ⅱ)中裂解。SDS溶解細胞膜的磷脂和蛋白成分，使細胞的內(nèi)容物如染色體、質粒DNA和蛋白在堿性環(huán)境下變性。佳的裂解時間是質粒大量釋放而沒有釋放染色體DNA的時間，盡量縮短質粒暴露在變性環(huán)境中。長時間處在堿性環(huán)境中會導致質粒發(fā)生不可恢復的變性。變性的質粒在瓊脂糖膠上跑的較快，而且不能被限制性內(nèi)切酶消化。裂解產(chǎn)物在溶液Ⅲ中被調(diào)整到中性高鹽環(huán)境，高鹽使得變性的蛋白、染色體DNA、細胞碎片和SDS都沉淀下來，而質粒復性留在上清溶液中。溶液要*混勻以確保沉淀*。為了防止染色體DNA污染質粒DNA，要避免劇烈振蕩，以防止染色體DNA被打斷，造成對質粒DNA的污染。因為染色體DNA的片段和質粒DNA在高鹽條件下，都可以與硅膠膜結合，在低鹽的條件下，用洗脫液都能從膜上洗脫下來。因此，在裂解過程中要緩慢、輕柔顛倒離心管。

質粒DNA分離和純化：
    純化要求
    質粒DNA中不應存在對后續(xù)實驗中的酶活性有抑制作用的有機溶劑分子或過高濃度的金屬離子。避免其它生物大分子如蛋白質、多糖、脂類、基因組和RNA的污染。不同的后續(xù)實驗對于質粒純度的要求不同，常規(guī)的分子生物學實驗(如酶切、測序等)普通純度的質粒即可滿足實驗，而對于轉染實驗，要求質粒的純度較高(如高純度或無內(nèi)毒素)?？梢赃x擇不同的質粒提取試劑盒以滿足不同的實驗要求。

純化方法
    用硅基質材料吸附質粒DNA來代替乙醇沉淀的純化方式，提取的質粒純度高、操作方便快捷，可選擇的試劑盒有兩種類型，即普通質粒提取試劑盒和無內(nèi)毒素質粒提取試劑盒。
 
質粒DNA的洗脫和收集
參見基因組DNA提取
 
質粒的保存
    溶解在洗脫液TE中的質粒DNA，也可以貯存在TE緩沖液中(用水溶解的質粒只能短期保存，因為實驗室用的純水呈弱酸性，質粒在酸性環(huán)境下會發(fā)生磷酸解)，4℃短期保存或-20℃和-70℃長期保存，也可在含有質粒的細菌培養(yǎng)物中，加等體積甘油，于-70℃保存 。
 
質粒鑒定與評價：
    瓊脂糖電泳檢測
    堿裂解法提取的質粒經(jīng)瓊脂糖電泳進行鑒定時，理想狀況是只出現(xiàn)超螺旋—條帶，但在質粒提取過程中，由于機械力、酸堿度、試劑等原因，使質粒DNA鏈發(fā)生斷裂，可能出現(xiàn)兩條帶或者出現(xiàn)三條帶，這三條帶電泳遷移率從快到慢，分別是超螺旋、開環(huán)和復制中間體(即沒有復制*的兩個質粒粘連在—起)。如果加溶液Ⅱ后過度振蕩，會在遠離這三條帶的位置出現(xiàn)條帶，這條帶泳動得較慢，是大腸桿菌基因組DNA的片斷。非常偶然的是，有時候提取的質粒會出現(xiàn)4個以上的條帶，這是由于特殊的DNA序列導致了不同程度的超螺旋(超螺旋的圈數(shù)不同)所致。但是，只要質粒經(jīng)單酶切鑒定后，只有單一條帶，就證明沒有基因組的污染。
 
酶切檢測
    質粒提取后，為了進—步鑒定質粒的正確與否，就要進行酶切鑒定，通過與Marker對比，確定質粒的分子量大小。
用紫外線分光光度計檢測濃度測定標準為：OD 260 值為1相當于大約50ug/ml雙鏈DNA。OD 260 /OD 280 比值在1.7-1.9之間說明所得DNA純度較好。OD 260 /OD 280 比值若低于1.7說明可能有蛋白污染。OD 260 /OD 280 比值若高于2.0則說明DNA有可能已降解。如果洗脫時不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，比值會偏低，因為pH值和離子濃度會影響光吸收值，但并不表示純度低。