實(shí)時(shí)定量技術(shù)，是指在PCR體系中加入
赫斯特?zé)晒馊玖?/a>，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)進(jìn)程，然后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。
該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，具有特異性強(qiáng)、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)。因此已得到廣泛應(yīng)用。
熒光染料的諸多特點(diǎn)使它可以用于多種應(yīng)用，包括：qPCR，高分辨率DNA熔解曲線（HRM）分析，常規(guī)的DNA定量以及毛細(xì)管電泳。當(dāng)染料和DNA結(jié)合后，其激發(fā)和發(fā)射光譜與熒光素以及熒光染料相似。
這使得該染料可以直接用于配置了488nm氬離子激光器或者此光譜區(qū)域內(nèi)任何可見光激發(fā)裝置的儀器。本身沒有熒光，但和dsDNA結(jié)合后能發(fā)出高亮度的熒光，這種特性使它特別適合于實(shí)時(shí)定量PCR的應(yīng)用。
另外，水溶性溶劑，如DMSO或者甘油，常被用來作為添加劑以穩(wěn)定。這些組分以及pH值需要根據(jù)您所選用的聚合酶的特性進(jìn)行優(yōu)化。如果您使用常規(guī)非熱啟動(dòng)Taq聚合酶，并配合使用，您將會(huì)獲得比熒光染料更優(yōu)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
由于各種儀器的光學(xué)設(shè)置不同，因此當(dāng)平行比較時(shí)，在不同儀器上的Ct值會(huì)有＋1或－1的微小差別。然而無論您使用哪種儀器，赫斯特?zé)晒馊玖系娜劢馇€分析中的熒光強(qiáng)度都遠(yuǎn)強(qiáng)于。
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