肉桂酸-4-羥化酶（C4H）活性檢測試劑盒說明書
紫外分光光度法
貨號：BC4080
規(guī)格：50T/48S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前取一瓶粉劑加入3 mL乙醇溶解備用。2-8℃保存4周。

2. 試劑三：臨用前取一瓶粉劑加入3 mL雙蒸水充分溶解待用?，F(xiàn)配現(xiàn)用。-20℃分裝可保存4周，避免反復凍融。

產品說明：
C4H又稱反式肉桂酸-4-單氧化酶，是催化桂皮酸形成咖啡豆、香豆酸的酶。C4H多存在于高等植物、酵母、菌類中，屬于細胞木質素合成途徑中間的關鍵酶。
C4H催化肉桂酸和NADPH生成4-香豆酸鹽和NADP，在340nm下測定NADPH的減少速率，即可反映C4H活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
    紫外分光光度計、低溫離心機、水浴鍋、可調式移液器、1mL石英比色皿、研缽/勻漿器、乙醇、冰和蒸餾水。
操作步驟：具體操作步驟詳見“產品資料"附件
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1、組織：稱取約0.1g組織，加入1mL提取液進行冰浴勻漿。12000g， 4℃離心15分鐘，取上清，置冰上待測。
2、細胞或細菌樣本的制備：先收集細胞或細菌樣本到離心管內，棄上清，按照每500萬細胞或細菌加入1mL提取液，超聲波破碎細菌或細胞（功率200w，超聲3s，間隔10s，重復30次）。12000g，4℃離心15min，取上清，置冰上待測。
二、測定步驟

1. 紫外分光光度計預熱30min，波長調至340nm，蒸餾水調零。

2. 加樣表（在1mL石英比色皿中分別加入）

充分混勻后立即測定10s時在340nm下的吸光度，記為A1，之后迅速將其放入37℃水浴或37℃培養(yǎng)箱中3min。然后迅速拿出擦凈后測定190s時的吸光度，記為A2。計算ΔA=A1-A2。

注意事項：
當ΔA大于0.4時，建議將樣本用提取液稀釋后測量；ΔA過小時，建議增加酶促反應時間（5min或10min）或增加加入的樣本體積來測定。
實驗實例：

1. 取0.1g黃豆（發(fā)芽）加入1mL提取液進行勻漿研磨，取上清后按照測定步驟操作，測得計算ΔA=A1-A2=1.643-1.510=0.133，按樣本質量計算酶活得：C4H酶活（U/g質量）=535.91×ΔA÷W=535.91×0.133÷0.1=712.76 U/g 質量。

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