磷酸丙糖異構(gòu)酶（TPI）活性檢測試劑盒說明書

紫外分光光度法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。

貨號：BC2260

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前取1瓶加入3mL蒸餾水，充分溶解；用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復凍融；

2、 試劑三：臨用前取1瓶加入3mL蒸餾水，充分溶解；用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復凍融；

3、 試劑四：提供一個棕色試劑空瓶，臨用前取一支試劑四加入2.5mL蒸餾水，充分溶解；用不完的試劑-20℃分裝保存2周，避免反復凍融。

產(chǎn)品說明：

植物葉綠體中磷酸丙糖異構(gòu)酶（TPI）是光合作用中參與calvin循環(huán)的重要酶。作用于磷酸甘油醛和磷酸二羥丙 酮之間的轉(zhuǎn)化，磷酸二羥丙 酮能快速透過葉綠體的包膜進入細胞質(zhì)，并在其中逐步轉(zhuǎn)化為蔗糖。

磷酸丙糖異構(gòu)酶將磷酸二羥丙 酮轉(zhuǎn)化為3-磷酸甘油醛，3-磷酸甘油醛與NAD在3-磷酸甘油醛脫氫酶的作用下生成3-磷酸甘油酸和NADH，340nm處的吸光度變化反映了磷酸丙糖異構(gòu)酶的活性的高低。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、天平、水浴鍋、臺式低溫離心機、1mL石英比色皿、可調(diào)式移液槍、細胞超聲破碎儀、研缽/勻漿器、冰、蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1. 總TPI提?。?/span>按照組織質(zhì)量（g）︰提取液一體積(mL)為1︰5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液一）進行冰浴勻漿，勻漿后冰浴超聲波破碎（功率200W，超聲3s，間隔7s，總時間1min），于4℃，8000g離心10min，取上清，置于冰上待測。

2. 胞漿和葉綠體TPI的分離：

（1） 按照組織質(zhì)量（g）︰提取液一體積(mL)為1︰5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液一）進行冰浴勻漿，勻漿后于4℃，200g離心5min，棄沉淀，留取上清。

（2） 上清于4℃，8000g離心10min，取上清用于測定胞漿TPI活性，

（3） 在第二步離心后的沉淀加1mL提取液二，震蕩混勻后冰浴超聲波破碎（功率200W，超聲3s，間隔7s，總時間1min），然后4℃，8000g離心10min，取上清測定葉綠體中TPI活性。

建議測定總TPI活性，按照步驟1提取粗酶液，若需要分別測定胞漿和葉綠體中的TPI，則按照步驟2提取粗酶液。

二、測定步驟

1. 紫外分光光度計預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑一預熱15min以上。

3. 測定管：依次取600μL試劑一、100μL試劑二、100μL試劑三、100μL試劑四和100μL粗酶液于1mL石英比色皿，迅速吹打混勻，立即記錄340nm處20s的吸光值A1，迅速置于37℃水浴鍋或培養(yǎng)箱5min，拿出迅速擦干測定5min20s時的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1。

三、磷酸丙糖異構(gòu)酶活性計算

1. 按樣本蛋白濃度計算

酶活單位定義：每mg組織蛋白每min生成1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

TPI活性（U/mg prot）＝(ΔA÷ε÷d)×V反×10⁹÷V樣÷Cpr÷T×F=321.54×ΔA÷Cpr×F

2. 按照樣本質(zhì)量計算

酶活單位定義：每g組織每min生成1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

TPI活性（U/g 質(zhì)量）＝(ΔA÷ε÷d)×V反×10⁹÷V樣×V提÷W÷T×F=321.54×ΔA÷W×F

ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；10⁹：單位換算系數(shù)，1mol=10⁹nmol；V反：反應總體積，1.0×10^-3L；V樣：加入樣本上清體積，0.1mL；V提：加入提取液一或提取液二的體積，1mL；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；T：反應時間，5min；F：稀釋倍數(shù)。

實驗實例：

1. 稱取0.11g綠蘿葉片加入1mL提取液一進行勻漿研磨，超聲破碎后離心取上清，按照測定步驟操作，用1mL石英比色皿測得計算ΔA= A2-A1=0.172-0.138=0.034，按樣本質(zhì)量計算酶活得：

TPI活性（U/g 質(zhì)量）＝321.54×0.034÷0.11=99.39 U/g 質(zhì)量。

2. 稱取0.1033g玉蘭葉片加入1mL提取液一進行勻漿研磨，超聲破碎后離心取上清，按照測定步驟操作，用1mL石英比色皿測得計算ΔA= A2-A1=1.101-1.056=0.045，按樣本質(zhì)量計算酶活得：

TPI活性（U/g 質(zhì)量）＝321.54×0.045÷0.1033=140.07 U/g 質(zhì)量。

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