土壤碳酸酐酶（S-CA）活性檢測試劑盒說明書

微量法

貨號：BC5505

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前取一支試劑二，先加入650μL丙酮使粉劑充分溶解，再加入6.7mL蒸餾水。未用完的試劑分裝保存，-20℃可以分裝保存1周，避免反復(fù)凍融。

2、 標(biāo)準(zhǔn)品：5μmol/mL 酚標(biāo)準(zhǔn)液。臨用前取50μL的5μmol/mL 酚標(biāo)準(zhǔn)液于中，加入750μL蒸餾水充分混合，配置成0.3125 μmol/mL的酚標(biāo)準(zhǔn)液。

產(chǎn)品說明：

碳酸酐酶（Carbonic Anhydrase, CA, EC4.2.1.1）是一種以Zn²⁺為活性中心的金屬酶，可用來高效催化CO₂的可逆水合反應(yīng)：CO₂+H₂0?HCO₃^-+H⁺，催化速率可達(dá)自然條件下的10⁷倍，是目前已知催化速率最快的酶之一。

碳酸酐酶可催化乙酸對硝基苯酯反應(yīng)生成對硝基苯*，通過檢測405nm處吸光值上升速率反映碳酸酐酶活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、30-50目篩、研缽、分析天平、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、甲苯、蒸餾水和冰。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

新鮮土樣自然風(fēng)干或37℃烘箱風(fēng)干，過 30~50目篩。

二、測定步驟

1、 可見分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至405nm，可見分光光度計用蒸餾水調(diào)零。

2、 試劑一使用前37℃預(yù)熱15min。

3、 標(biāo)準(zhǔn)管測定

（1） 標(biāo)準(zhǔn)管測定：在1.5mL EP管內(nèi)中加入80μL標(biāo)準(zhǔn)液，320μL試劑一，充分混勻后，吸取0.2mL于微量玻璃比色皿/96孔板中測定405nm處吸光值，記作A_{標(biāo)準(zhǔn)}。

（2） 標(biāo)準(zhǔn)空白管測定：在1.5mL EP管內(nèi)中加入80μL蒸餾水，320μL試劑一，充分混勻后，吸取0.2mL于微量玻璃比色皿/96孔板中測定405nm處吸光值，記作A_{標(biāo)準(zhǔn)空白}。

（3） 計算?A_{標(biāo)準(zhǔn)}=A_{標(biāo)準(zhǔn)}-A_{標(biāo)準(zhǔn)空白}。（標(biāo)準(zhǔn)管和標(biāo)準(zhǔn)空白管只需做1-2次。）

4、 操作表：（在1.5mLEP管內(nèi)加入）

三、土壤CA活性計算

按樣本質(zhì)量計算

單位的定義：37℃，每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1μmol 對硝基苯*定義為一個酶活力單位。

S-CA活性（U/g 質(zhì)量）= C_標(biāo)×?A÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}×V_{標(biāo)準(zhǔn)}÷W÷T×F=0.005×?A÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}÷W×F

C_標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)品濃度，0.3125μmol/mL；V_{標(biāo)準(zhǔn)}：反應(yīng)體系中加入的標(biāo)準(zhǔn)液體積，0.08mL；T：反應(yīng)時間，5min； W：樣本質(zhì)量，g； F：樣本稀釋倍數(shù)。

注意事項：

1、 如果A_測定大于1.5或者?A大于0.8，可以減少樣本量或者縮短37℃酶促反應(yīng)時間；?A小于0.02，可以加大樣本量或者延長37℃酶促反應(yīng)時間。注意計算時同步修改計算公式。

2、 如果離心后待測的上清依然渾濁，可嘗試加大離心轉(zhuǎn)速或延長時間，例如20000g，4℃，離心10min。

實驗實例：

1、 稱取0.1016g土壤樣本16號，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算?A =A_測定-A_對照=0.353-0.227=0.126，?A_{標(biāo)準(zhǔn)}=A_{標(biāo)準(zhǔn)}-A_{標(biāo)準(zhǔn)空白}=0.65-0.046=0.604，帶入公式計算：

S-CA活性（U/g 質(zhì)量）=0.005×?A÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}÷W×F =0.010 U/g 質(zhì)量

2、 稱取0.1056g土壤樣本62號，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算?A =A_測定-A_對照=0.577-0.271=0.306，?A_{標(biāo)準(zhǔn)}=A_{標(biāo)準(zhǔn)}-A_{標(biāo)準(zhǔn)空白}=0.65-0.046=0.604，帶入公式計算：

S-CA活性（U/g 質(zhì)量）=0.005×?A÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}÷W×F =0.024 U/g 質(zhì)量

參考文獻(xiàn)：

[1] Li W ,Yu L J , Yuan D X , et al. A study of the activity and ecological significance of carbonic anhydrase from soil and its microbes from different karst ecosystems of Southwest China[J]. Plant and Soil, 2005, 272(1):133-141.

相關(guān)系列產(chǎn)品：

BC0150/BC0155 土壤纖維素酶（S-CL）活性檢測試劑盒

BC0160/BC0165 土壤β-葡萄糖苷酶（S-β- GC）活性檢測試劑盒