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| 品牌 | SOLARBIO/索萊寶 | CAS | 詳詢 |
|---|---|---|---|
| 分子式 | 詳詢 | 純度 | 詳詢 |
| 分子量 | 詳詢 | 貨號 | BC3840 |
| 規(guī)格 | 20T 50T 100T | 供貨周期 | 現(xiàn)貨 |
| 主要用途 | Caspase-4活性測定 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)業(yè),綜合 |
Caspase-4活性檢測試劑盒說明書
比色法
貨號：BC3840
規(guī)格：20T、50T、100T
產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。
20T | 50T | 100T | 保存條件 | |
試劑一 | 液體20 mL×1瓶 | 液體20 mL×1瓶 | 液體25 mL×1瓶 | -20℃保存 |
試劑二 | 液體30 mL×1瓶 | 液體60 mL×1瓶 | 液體120 mL×1瓶 | |
試劑三 | 液體0.55 mL×1支 | 液體0.55 mL×2支 | -20℃保存 | |
標(biāo)準(zhǔn)品 | 液體1mL×1支 | 液體1 mL×1支 | 液體1 mL×1支 | -20℃保存 |
溶液的配制：
1、 試劑一：分裝-20℃保存。
2、 試劑二：分裝-20℃保存。
3、 標(biāo)準(zhǔn)品：pNA標(biāo)準(zhǔn)溶液，5 mmol/L。標(biāo)準(zhǔn)溶液在4℃條件下為渾濁狀態(tài)，溶解即可變?yōu)槌吻鍫顟B(tài)，不影響使用。
4、 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液配制：取9 mL試劑一加入1 mL試劑二，充分混勻待用。（也可按照試劑一：試劑二=9:1的比例，自行配制）。
產(chǎn)品說明：
Caspase是參與細(xì)胞凋亡過程的蛋白酶家族，包含10多個(gè)成員。Caspase-4可以和Apaf-1相互作用，并參與細(xì)*素c導(dǎo)致的Caspase-3激活，也可以和caspase-14相互作用。
試劑盒測定原理基于Caspase-4特異水解其多肽底物Ac-LEVD-pNA，釋放出游離的硝基苯胺pNA，后者呈黃色在405 nm具有最大吸收峰，采用可見光光度比色法測定。
注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、100μL玻璃比色皿/96孔板、臺式離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液器、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）
1、培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)胞數(shù)量（約106個(gè)）加100μL試劑二（若裂解不充分可提高至150-200 μL），震蕩重懸沉淀，置冰上靜置15 min，4℃，15000g離心10-15min，取上清置冰上待測。
2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑二體積（mL）為1：5~10的比例（建議稱取約0.1 g組織，加入1 mL試劑二），冰浴研磨或充分剪碎，置冰上靜置15 min，4℃，15000g離心10-15min，取上清置冰上待測。
二、測定步驟
1、 可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至405nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 臨用前用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液將5 mmol/L pNA標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至200、100、50、25、12.5、0μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液待用。
3、 樣本測定（在96孔板/EP管中按順序加入以下試劑）
試劑名稱（μL） | 測定管 | 空白管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 |
試劑一 | 40 | 40 | |
樣本 | 50 | ||
試劑二 | 50 | ||
試劑三 | 10 | 10 | |
標(biāo)準(zhǔn)溶液 | 100 | ||
混勻，蓋緊96孔板蓋子并用封口膜密封。37℃孵育60-120分鐘。發(fā)現(xiàn)顏色變化比較明顯時(shí)即可測定405nm處吸光值。如果顏色變化不明顯，可以適當(dāng)延長孵育時(shí)間，甚至可以孵育過夜。空白管只需做1-2次。計(jì)算ΔA測定=A測定管-A空白管。 | 立即測定405nm下吸光度 | ||
三、Caspase-4活性計(jì)算
1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（x，μmol/L）和ΔA標(biāo)準(zhǔn)（y，減去濃度為0的空白管）做標(biāo)準(zhǔn)方程。將ΔA測定代入標(biāo)準(zhǔn)方程得到x（μmol/L）。
2. 按酶活性增加百分比計(jì)算
Caspase-4活性增加百分比=（實(shí)驗(yàn)處理組A測定-A空白管）/（實(shí)驗(yàn)對照組A測定-A空白管）×100%
該方法簡單可靠，可粗略反應(yīng)酶活性情況。
3. 按酶活計(jì)算
參考Chemicon公司的caspase酶活力單位的定義：One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric pNA-substrate per hour at 37℃ under saturated substrate concentrations。即一個(gè)酶活力單位定義為當(dāng)?shù)孜镲柡蜁r(shí)，在37℃一個(gè)小時(shí)內(nèi)可以剪切1nmol pNA底物產(chǎn)生1nmol游離 pNA的酶量。這樣就可以計(jì)算出樣本中含有多少個(gè)酶活力單位的caspase酶活性。
Caspase-4活性（U/mg prot）=x×V反總÷（V樣×Cpr）÷T×103=2x÷Cpr÷T
V反總：反應(yīng)體系總體積，0.1mL=10-4L；V樣：加入的樣本體積，0.05mL；T：反應(yīng)時(shí)間，h；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；103：單位換算系數(shù)，1μmol =103nmol。
注意事項(xiàng)：
1、由于試劑二中含有還原劑（DTT），建議將樣本用水稀釋2倍后，用Bradford法測定蛋白濃度，以降低DTT對蛋白濃度測定的干擾。不建議使用BCA法測定蛋白濃度。
2、Caspase活性測定值低最常見的原因是細(xì)胞未發(fā)生凋亡或細(xì)胞量太少，其次是觀測時(shí)間不恰當(dāng)。誘導(dǎo)凋亡時(shí)，并非劑量越大時(shí)間越長Caspase活性就越高。建議設(shè)置不同劑量和時(shí)間點(diǎn)如0、2、4、8、16、24小時(shí)，以檢測最佳的觀察點(diǎn)。
3、所測樣本的值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，可用試劑二稀釋樣本后重新測定
4、蓋緊96孔板蓋子并用封口膜密封。37oC孵育，肉眼可見顏色變黃時(shí)的OD405值約為0.2，此時(shí)即可測定。顏色變化不明顯可延長反應(yīng)或過夜，但酶活性較強(qiáng)時(shí)，孵育時(shí)間過長將導(dǎo)致反應(yīng)失去線性關(guān)系。
參考文獻(xiàn)：
[1] Cohen GM. Caspases: the executioners of apoptosis. Biochem J, 1997, 326: 1-16.
[2] Janicke R U, Sprengart M L, Wati M R, et al. Emerging role of caspase-3 in apoptosis[J]. Cell Death and Differentiation, 1999, 6:99-104.
相關(guān)系列產(chǎn)品：
BC3810 Caspase-1活性檢測試劑盒
BC3820 Caspase-2活性檢測試劑盒
BC3830 Caspase-3活性檢測試劑盒
BC3850 Caspase-5活性檢測試劑盒
BC3860 Caspase-6活性檢測試劑盒
BC3880 Caspase-8活性檢測試劑盒
BC3890 Caspase-9活性檢測試劑盒
Caspase-4活性測定試劑盒 常量法 Caspase-4活性測定試劑盒 常量法
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